傳代細(xì)胞培養(yǎng)與病毒在傳代細(xì)胞中的培養(yǎng)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>
了解倒置顯微鏡的構(gòu)造與使用，了解不同傳代細(xì)胞的形態(tài)及接毒后的病變特征，掌握細(xì)胞的傳代培養(yǎng)方法、病毒接種方法及收毒方法。
二、常用細(xì)胞的種類
BHK-21：倉(cāng)鼠腎傳代細(xì)胞
PK-15：豬腎傳代細(xì)胞
IBRS-2：豬腎傳代細(xì)胞
Hela：人的子宮瘤細(xì)胞
Vero：非洲綠猴腎細(xì)胞
Marc-145：來(lái)源于Vero細(xì)胞
TK-143：人的胸苷激酶陰性細(xì)胞
Sf9：昆蟲細(xì)胞  
三、材料
1、100ml細(xì)胞瓶、吸管、吸球、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、加樣器、槍頭
2、BHK-21（baby hamster kidney）細(xì)胞
3、0.25%胰酶
4、生長(zhǎng)液：含10%犢牛血清、200U/ml青、鏈霉素的DMEM
  維持液：含2-5%犢牛血清、200U/ml青、鏈霉素的DMEM
5、偽狂犬病病毒液（PRV）
四、傳代細(xì)胞培養(yǎng)的條件要求
1）細(xì)胞密度：2-3×10⁵個(gè)/ml
2）pH范圍   **適pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8
3）培養(yǎng)溫度
   哺乳動(dòng)物細(xì)胞一般為37℃
   昆蟲細(xì)胞28-30℃
五、常用細(xì)胞分散劑與作用原理
1、胰酶  使精氨酸或賴氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之間的多肽鏈發(fā)生水解，導(dǎo)致細(xì)胞間質(zhì)水解而使細(xì)胞或組織塊消化為分散的單個(gè)細(xì)胞。
2、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）：與二價(jià)鈣、鎂離子結(jié)合，從而使細(xì)胞分散。
3、灰色鏈絲菌酶 ：由灰色鏈絲菌提取的一種酶制劑，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶的混合物。
六、營(yíng)養(yǎng)液
1、人工綜合營(yíng)養(yǎng)液
氨基酸、糖類、無(wú)機(jī)鹽類、維生素、輔酶、嘌呤、嘧啶、輔助生長(zhǎng)因子。
2、血清
1）血清的種類
    胎牛血清、新生犢牛血清、成年牛血清、馬血清、雞血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犢牛血清使用**為廣泛。
2）血清的處理
無(wú)菌采集，過濾除菌。用前56℃滅活30min。
3）血清的作用
A、能提供細(xì)胞生存、生長(zhǎng)和增生所必須的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子。
B、能補(bǔ)充基礎(chǔ)培養(yǎng)液中沒有或量不足的營(yíng)養(yǎng)成分。
C、含有一些可供貼壁依賴型細(xì)胞在培養(yǎng)器皿表面貼附和鋪展的生長(zhǎng)基質(zhì)成分。
D、有中和毒性物質(zhì)保護(hù)細(xì)胞不受傷害的作用。
E、給培養(yǎng)液提供良好的緩沖系統(tǒng)。
F、提供蛋白酶抑制劑，保護(hù)細(xì)胞免受細(xì)胞釋放的蛋白酶的損害。
4）應(yīng)用血清存在的問題
A、血清中存在不少有害于細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖的物質(zhì)：補(bǔ)體、免疫球蛋白、生長(zhǎng)抑制因子。
B、血清的成分不明確，影響對(duì)結(jié)果的分析。
C、不同動(dòng)物、不同批次的血清成分和活性差別較大，使得培養(yǎng)結(jié)果不穩(wěn)定。
七、傳代細(xì)胞系培養(yǎng)
1、優(yōu)點(diǎn)：1) 可以無(wú)限的傳代。
2) 不少細(xì)胞系對(duì)病毒很敏感。
3) 某些傳代細(xì)胞系能在懸浮培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，適合病毒抗原的大量生產(chǎn)。
4) 生長(zhǎng)旺盛，繁殖快速，對(duì)營(yíng)養(yǎng)條件不苛刻。
缺點(diǎn)：在傳代過程中遭到支原體和病毒的污染。
培養(yǎng)方法
1）取長(zhǎng)滿單層的細(xì)胞一瓶，傾去培養(yǎng)液。
2）加入2ml 胰酶消化液，于37℃培養(yǎng)箱放置幾分鐘，**細(xì)胞間出現(xiàn)空隙或細(xì)胞變圓后，倒去消化液。
3）加入生長(zhǎng)液,反復(fù)吹打幾次，使細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞，然后分裝于3個(gè)小瓶中。再在每個(gè)小瓶中補(bǔ)充生長(zhǎng)液**10ml，然后置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)1-2天即可長(zhǎng)成單層。
八、病毒（PRV）在傳代細(xì)胞中的培養(yǎng)
1、選長(zhǎng)滿單層的細(xì)胞，倒掉培養(yǎng)液。
2、加入適量的病毒懸液
3、置溫箱中感作（吸附）45min-1h。
4、取出瓶子，倒掉或不倒掉培養(yǎng)液，補(bǔ)足維持液，置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)，直**80%以上的細(xì)胞病變。
5、收毒：將病變的細(xì)胞置于-20℃冰箱中，凍結(jié)后取出自然解凍，在解凍過程中振搖幾次，以使細(xì)胞完全從瓶壁上脫落。然后將病毒液收集于鹽水瓶或其它容器中。低溫貯藏備用。
 
實(shí)驗(yàn)四  病毒感染力的滴定（TCID₅₀的測(cè)定）
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>
    了解病毒感染力測(cè)定的幾種常用方法，掌握半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量TCID₅₀的操作步驟、計(jì)算方法及含義。
二、測(cè)定病毒感染力的方法
半數(shù)致死量LD₅₀( 50% lethal dose)：用動(dòng)物或雞胚來(lái)檢測(cè)
半數(shù)雞胚感染量EID₅₀(egg 50% infective dose)：用雞胚來(lái)檢測(cè)
半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量TCID₅₀（50% tissue culture infective dose)：用細(xì)胞來(lái)檢測(cè)
蝕斑形成單位（plaque forming unit，PFU）：用細(xì)胞來(lái)檢測(cè)
三、材料 
1、長(zhǎng)滿單層的細(xì)胞1瓶
2、胰酶、吸球、吸管、生長(zhǎng)液
3、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板
4、加樣器、槍頭
5、病毒液（PRV）
四、TCID₅₀的操作步驟
1、在青霉素瓶或離心管中將病毒液作連續(xù)10倍的稀釋，從10^-1-10^-10。
2、將稀釋好的病毒接種到96孔微量培養(yǎng)板中，每一稀釋度接種一縱排共8 孔，每孔接種100µl。
3、在每孔加入細(xì)胞懸液100µl，使細(xì)胞量達(dá)到2~3×10⁵個(gè)/ml。
4、設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照，正常細(xì)胞對(duì)照作兩縱排。（100µl生長(zhǎng)液+100µl細(xì)胞懸液）#p#分頁(yè)標(biāo)題#e##p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
5、逐日觀察并記錄結(jié)果，一般需要觀察5-7天。
6、結(jié)果的計(jì)算，按Reed-Muench兩氏法或Karber法
五、TCID₅₀的計(jì)算方法
1、Reed-Muench兩氏法

病毒液稀釋度	出現(xiàn)CPE孔數(shù)	無(wú)CPE孔數(shù)	累    計(jì)		出現(xiàn)CPE孔所占的%
			CPE孔數(shù)	無(wú)CPE孔數(shù)
10-1	8	0	27	0	100（27/27）
10-2	8	0	19	0	100（19/19）
10-3	7	1	11	1	91.6 （11/12）
10-4	3	5	4	6	40（4/10）
10-5	1	7	1	13	0.7（1/14）
10-6	0	8	0	21	0（0/21）

CPE：Cytopathic effect
距離比例＝（高于50%病變率的百分?jǐn)?shù)-50%）/（高于50%病變率的百分?jǐn)?shù)-低于50%病變率的百分?jǐn)?shù)）
        ＝（91.6-50）/（91.6-40）
       ＝ 0.8
lgTCID₅₀=距離比例×稀釋度對(duì)數(shù)之間的差+高于50%病變率的稀釋度的對(duì)數(shù)
       =0.8×(-1)+(-3)
       =-3.8
TCID₅₀=10^-3.8/0.1ml
含義：將該病毒稀釋10^3.8接種100µl可使50%的細(xì)胞發(fā)生病變。
2、Karber法

病毒液稀釋度	出現(xiàn)CPE的孔數(shù)	出現(xiàn)CPE孔的比率
10-1	8	8/8=1
10-2	8	8/8=1
10-3	7	7/8=0.875
10-4	3	3/8=0.375
10-5	1	1/8=0.125
10-6	0	0/8=0

 
lgTCID₅₀=L-d(s-0.5)
L：**高稀釋度的對(duì)數(shù)
D：稀釋度對(duì)數(shù)之間的差
S：陽(yáng)性孔比率總和
lgTCID₅₀=-1-1×(3.375-0.5)
       =-3.875
TCID₅₀=10^-3.875/0.1ml
含義：將該病毒稀釋10^3.875接種100µl可使50%的細(xì)胞發(fā)生病變。
 
  
Marc 145細(xì)胞培養(yǎng)和維持綜述 
發(fā)布: 2010-02-10 來(lái)自: 易生物實(shí)驗(yàn) 閱讀數(shù)：5241次 
一、 細(xì)胞及培養(yǎng)
1、Marc145細(xì)胞
上皮樣細(xì)胞，來(lái)源于猴腎細(xì)胞，從母細(xì)胞（MA 104細(xì)胞）克隆而得到，可連續(xù)培養(yǎng)。
2、生長(zhǎng)培養(yǎng)基
DMEM（高糖型，含4500mg/L D－葡萄糖、L-谷氨酰胺，和110mg/L丙酮酸鈉，不含碳酸氫鈉）＋5－10％新生牛血清+ 1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的培養(yǎng)液。
3、凍存液
生長(zhǎng)培養(yǎng)基＋10% DMSO
4、細(xì)胞健康生長(zhǎng)的幾項(xiàng)注意事項(xiàng)
（1）細(xì)胞沒有支原體等外源因子的感染。
（2）培養(yǎng)液的pH值可在7.0－7.3，以7.2為佳。#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
（3）一般按1：3傳代，細(xì)胞接種密度為1－1.5×105cells/ml，48hr后長(zhǎng)成單層。#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
（4）培養(yǎng)基和血清的質(zhì)量可靠、穩(wěn)定；建議采用特級(jí)小牛血清。
（5）細(xì)胞及時(shí)傳代，不可以在老化后傳代，一般在剛長(zhǎng)成細(xì)胞單層時(shí)進(jìn)行傳代、擴(kuò)增。
（6）細(xì)胞傳代時(shí)消化液用0.25%胰蛋白酶+0.03%EDTA，消化過程應(yīng)盡量縮短在1～2分鐘內(nèi)完成。
二、 病毒感染、維持和收獲
轉(zhuǎn)瓶中細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，棄瓶?jī)?nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)液，接種PRRS病毒。37℃吸附1hr，加入維持液，置37℃恒溫室轉(zhuǎn)瓶機(jī)上旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)3－5天。
維持液：DMEM+4～5％新生牛血清。
pH應(yīng)為7.4～7.8；后期維持pH會(huì)慢慢降下來(lái)。
細(xì)胞病變時(shí)間出現(xiàn)在接毒后48小時(shí)，72～96小時(shí)細(xì)胞病變達(dá)80％左右，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)80%以上病變（CPE）時(shí)，即可開始收毒；反復(fù)傳過幾代后病變時(shí)間可縮短。
第3、4天注意觀察，細(xì)胞病變（CPE）達(dá)到80％時(shí)收獲病毒，－20℃凍融3次，混勻病毒懸液，96孔板測(cè)定TCID50。
收液時(shí)需要將含毒細(xì)胞反復(fù)凍融2～3次以破碎細(xì)胞，將病毒釋放到培養(yǎng)液中。
三、 細(xì)胞病變（CPE）
細(xì)胞在接種病毒后，24－48hr開始出現(xiàn)病變，72－96hr約達(dá)到80％病變。病變現(xiàn)象：細(xì)胞空泡化、圓縮、先灶狀脫落，再大片脫落，**后整個(gè)細(xì)胞裂解、破碎。圖1是指PRRSV感染后，出現(xiàn)細(xì)胞病變的Marc 145細(xì)胞。
四、 PRRS病毒在細(xì)胞中增殖規(guī)律（ Virology Journal, 2006, 3: 90）
PRRS病毒感染Marc 145細(xì)胞過程可大致分為兩個(gè)感染階段，**階段：病毒感染細(xì)胞后的20－22hr左右，僅部分細(xì)胞被隨機(jī)感染，而且Marc 145細(xì)胞對(duì)PRRS病毒的低感染性（low permissiveness）與MOI量無(wú)關(guān)，因?yàn)镸OI劑量比常規(guī)量提高100倍，感染22hr后，仍僅5.5%的細(xì)胞呈PRRSV陽(yáng)性（PRRSV-positive）。第二階段：感染后的2－3天（也稱為病毒的對(duì)數(shù)感染期），病毒感染蔓延是通過相鄰細(xì)胞和細(xì)胞之間的接觸感染，細(xì)胞對(duì)自由病毒不敏感（Cells is nonpermissive to free Virus），并出現(xiàn)了感染細(xì)胞群。 感染過程如圖5所示。
對(duì)我們的一點(diǎn)啟示：可以采用適當(dāng)?shù)土康腗OI進(jìn)行病毒感染，比如0.05virus/cell；同時(shí)，大部分細(xì)胞在維持期的**天尚需繼續(xù)生長(zhǎng)，而且病毒在2－4天才是感染、增殖的高峰，較長(zhǎng)的病毒維持期均需要供給豐富的營(yíng)養(yǎng)物資，可以相信：維持液的營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)病毒增殖效率有非常重要的影響
細(xì)胞的復(fù)蘇
一、細(xì)胞復(fù)蘇的原則
在實(shí)際操作中，凍存細(xì)胞要進(jìn)行復(fù)蘇，再培養(yǎng)傳代。復(fù)蘇細(xì)胞一般采用快速融化法。以保證細(xì)胞外結(jié)晶快速融化，以避免慢速融化水分滲入細(xì)胞內(nèi)，再次形成胞內(nèi)結(jié)晶損傷細(xì)胞。
二、細(xì)胞復(fù)蘇的主要操作步驟
(1)佩戴眼鏡和手套，從液氮罐中取出安瓿或冷凍管。
(2)迅速放入38℃水浴中，并不時(shí)搖動(dòng)，在1分鐘內(nèi)使其完全融化，然后在無(wú)菌下取出細(xì)胞。
(3)在1000r/min速度下離心5～10分鐘，棄去上層液，加入適量培養(yǎng)液后接種于培養(yǎng)瓶中，接種濃度1×109/L，置37℃溫箱靜置培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)情況。若細(xì)胞密度較高，及時(shí)傳代。或無(wú)需離心直接將細(xì)胞加入瓶中，并加入培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)12～24小時(shí)后，充去上清，換入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
三、注意事項(xiàng)
在細(xì)胞復(fù)蘇操作時(shí)，應(yīng)注意融化凍存細(xì)胞速度要快，可不時(shí)搖動(dòng)安瓿或冷凍管，使之盡快通過**易受損的溫度段(-5～0℃)。這樣復(fù)蘇的凍存細(xì)胞存活率高，生長(zhǎng)及形態(tài)良好。然而，由于凍存的細(xì)胞還受其他因素的影響，有時(shí)也會(huì)有部分細(xì)胞死亡。此時(shí)，可將不貼壁、飄浮在培養(yǎng)液上(已死亡)的細(xì)胞輕輕倒掉，再補(bǔ)以適量的新培養(yǎng)液，也會(huì)獲得較為滿意的結(jié)果。