1. 如何選用特殊細(xì)胞系培養(yǎng)基？ 

培養(yǎng)某一類型細(xì)胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)的細(xì)胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長。總之，**MEM做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是一個好的開始。

2. 何時須更換培養(yǎng)基？ 

視細(xì)胞生長密度而定， 或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時間，按時更換培養(yǎng)基即可。

3. 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基？ 

不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細(xì)胞培養(yǎng)基， 若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基， 細(xì)胞大都無法立即適應(yīng)， 造成細(xì)胞無法存活。

4 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類？ 

不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源，所以血清的種類和品質(zhì)對于細(xì)胞的生長會產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清， 在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細(xì)胞無法存活。

5 何謂FBS, FCS, CS, HS ? 

FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 兩者都是指胎牛血清， FCS 乃錯誤的使用字眼， 請不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。

6 培養(yǎng)細(xì)胞時應(yīng)使用5 % 或10% CO2？或根本沒有影響？ 

一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統(tǒng)， 而培養(yǎng)基中NaHCO3 的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時應(yīng)使用的CO2 濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時，細(xì)胞培養(yǎng)時應(yīng)使用10 % CO2；當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時， 則應(yīng)使用5 % CO2 培養(yǎng)細(xì)胞。

7.Hank's 平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用，不需要CO2培養(yǎng)箱。原因是什么？Hank's 平衡鹽溶液(HBS)和Earle's平衡鹽溶液(EBS)有什么本質(zhì)的功能差別？ 

HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中，溶液會變堿，Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織，需要用Eagles液，。如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲存的組織，用Hanks液就可以了。

8. 細(xì)胞之接種密度為何？ 

依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無法生長之一重要原因。

9. 懸浮性細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理？ 

一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中， 稀釋細(xì)胞濃度即可， 若培養(yǎng)液太多時， 可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高， 直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細(xì)胞之培養(yǎng)液**另一新的培養(yǎng)角瓶， 加入新鮮培養(yǎng)基稀釋**適當(dāng)濃度， 重復(fù)前述步驟即可。

10.冷凍管應(yīng)如何解凍？ 

取出冷凍管后， 須立即放入37 °C 水槽中快速解凍， 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化， 并注意水面不可超過冷凍管蓋沿， 否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時， 必須注意安全， 預(yù)防冷凍管之爆裂。

11. 細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時， 是否應(yīng)馬上去除DMSO？ 

除少數(shù)特別注明對DMSO 敏感之細(xì)胞外， jue大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞）， 在解凍之后， 應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中， 待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無法生長或貼附之問題。

12. 附著性細(xì)胞繼代時所使用之trypsin-EDTA 濃度？應(yīng)如何處理？ 

一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。**次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中， 保存于–20 °C，避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin 之活性降低， 并可減少污染之機會。

13.欲將一般動物細(xì)胞離心下來，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？ 

欲回收動物細(xì)胞， 其離心速率一般為300xg (約1,000rpm)，5 - 10 分鐘， 過高之轉(zhuǎn)速， 將造成細(xì)胞死亡。

14. 細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？ 

動物細(xì)胞冷凍保存時**常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來細(xì)胞生長用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能， 故不可將DMSO 直接加入細(xì)胞液中， 必須使用前先行配制完成。

15.DMSO 之等級和無菌過濾之方式為何？ 

冷凍保存使用之DMSO 等級， 必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)， 其本身即為無菌狀況， **次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中， 保存于4°C， 避免反復(fù)冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質(zhì)， 并可減少污染之機會。若要過濾DMSO， 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質(zhì)濾膜。

16.冷凍保存細(xì)胞之方法？ 

冷凍保存方法一: 冷凍管置于4 °C 30~60 分鐘→ (-20 °C30 分鐘*) → -80 °C 16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長期儲存。

冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 °C **–80 °C 以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 °C 不可超過1 小時， 以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80°C 冰箱中，惟存活率稍微 降低一些。#p#分頁標(biāo)題#e##p#分頁標(biāo)題#e#

17. 細(xì)胞欲冷凍保存時， 細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？ 

冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1x106 cells/ml vial， 融合瘤細(xì)胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。

18.培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？ 

除于特殊篩選系統(tǒng)中外， 一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下， 培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。

19.應(yīng)如何避免細(xì)胞污染？ 

細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因為無菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細(xì)胞等。嚴(yán)格之無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細(xì)胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染之**好方法。

20.如果細(xì)胞發(fā)生微生物污染時，應(yīng)如何處理？ 

原則上：直接滅菌后丟棄之。

當(dāng)重要的培養(yǎng)污染時，研究者可能試圖消除或控制污染。shou先，確定污染物是細(xì)菌、真菌、支原體或酵母，把污染細(xì)胞與其它細(xì)胞系隔離開，用實驗室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺，檢查HEPA過濾器。
高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細(xì)胞系有毒性，因而，做劑量反應(yīng)實驗確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實驗步驟。

1.在無抗生素的培養(yǎng)基中消化、計數(shù)和稀釋細(xì)胞，稀釋到常規(guī)細(xì)胞傳代的濃度。

2.分散細(xì)胞懸液到多孔培養(yǎng)板中，或幾個小培養(yǎng)瓶中。在一個濃度梯度范圍內(nèi)，把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如，兩性霉素B推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。

3.每天觀測細(xì)胞毒性指標(biāo)，如脫落，出現(xiàn)空泡，匯合度下降和變圓。

4.確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2～3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞2～3代。

5.在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞一代。

6.重復(fù)步驟4。

7.在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～6代，確定污染是否以已被消除。

21.支原體(mycoplasma) 污染的細(xì)胞， 是否能以肉眼觀察出異狀？ 

不能。除極有經(jīng)驗之**外，大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株， 無法以其外觀分辨之。

22.支原體污染會對細(xì)胞培養(yǎng)有何影響？ 

支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞之生長參數(shù)， 代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進行實驗前，必須確認(rèn)細(xì)胞為mycoplasma-free，實驗結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。

23. 偵測出細(xì)胞株有支原體污染時， 該如何處理？ 

直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細(xì)胞株。

24. CO2 培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔？ 

定期(**少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。

25.為何培養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中， 顏色會偏暗紅色， 且pH值會越來越偏堿性？ 

培養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中， 培養(yǎng)基內(nèi)之CO2 會逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果， 將造成細(xì)胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時， 可以通入無菌過濾之CO2， 以調(diào)整pH 值。

26. 各種細(xì)胞培養(yǎng)用的dish，flask是否均相同？ 

不同廠牌的dish 或flask， 其所coating 的polymer 不同， 制造程序亦不同， 雖對大部分細(xì)胞沒有太大之影響， 惟少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長差異。

27. 購買之細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少之情形？ 

研究人員在冷凍細(xì)胞之培養(yǎng)時出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少， 大都是因為離心過程操作上的失誤， 造成細(xì)胞的物理性損傷， 以及細(xì)胞流失。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心， 應(yīng)待細(xì)胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。

28.購買之細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因？ 

研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時出現(xiàn)存活率不佳， 常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過程錯誤。冷凍細(xì)胞解凍后， 加以洗滌細(xì)胞和離心。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞。培養(yǎng)溫度使用錯誤。細(xì)胞置于–80 °C 太久。
30.L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？ 

L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有**終定論。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對于一些細(xì)胞具有毒性。

31.GlutaMAX-I是什么？培養(yǎng)細(xì)胞如何利用GlutaMAX-I？這個二肽有多穩(wěn)定？ 

GlutaMAX-I 二肽是一個L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩(wěn)定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。
GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I 二肽溶液有**小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎完全降解。

32.什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？ 
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酚紅在培養(yǎng)基中用作PH值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，（特別是雌激素）。為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類細(xì)胞時，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測時，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。#p#分頁標(biāo)題#e#

33.如何用臺盼蘭計數(shù)活細(xì)胞？ 

用無血清培養(yǎng)基把細(xì)胞懸液稀釋到200～2000個/毫升，在0.1毫升細(xì)胞懸液中加0.1毫升0.4％的臺盼蘭溶液。輕輕混勻，數(shù)分鐘后，用血球計數(shù)板計數(shù)細(xì)胞。活細(xì)胞排斥臺盼蘭，因而染成藍色細(xì)胞是死細(xì)胞。

34.培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？ 

丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源，盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。

35.二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么？ 

二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前，用EDTA清洗細(xì)胞，以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價離子。

36.室溫下配制的Tris-HCl溶液，在37℃使用時PH值是多少？ 

緩沖液PH值隨溫度變化而變化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃時，不同PH值。

50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃時，不同PH值

4°C	25°C	37°C
8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 8.6 8.7 8.8 8.9 9.0 9.1 9.2 9.3 9.4	8.5 7.6 7.7 7.8 7.9 8.0 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 8.6 8.7 8.8	7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 7.9 8.0 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5

37.如何從T25瓶中轉(zhuǎn)移sf9細(xì)胞？能用胰蛋白酶消化嗎？

我們推薦使用脫落細(xì)胞的方法，此技術(shù)破壞性**小，生活力**高。通過使用巴斯德吸液管，讓細(xì)胞上培養(yǎng)基流動。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養(yǎng)瓶。只有在**必要的情況下，才使用胰酶消化細(xì)胞。

38.胰酶消化一個T25瓶的sf9細(xì)胞：

1. 去除培養(yǎng)基。

2. 用2ml 1xPBS（足以覆蓋細(xì)胞表面）洗滌細(xì)胞，去除PBS。

3. 加入2ml 1x胰酶EDTA（恰好覆蓋細(xì)胞表面）。

4. 37 ℃孵育5到10分鐘。在儀器下檢測看到5分鐘后它們正在向上移動。

5. 向細(xì)胞中加入2ml 細(xì)胞培養(yǎng)液，移入錐形管，用2ml培養(yǎng)液洗瓶壁，移入同一錐形管中。（培養(yǎng)基中的FBS終止了胰酶的活性。）

6. 離心（1100rpm）沉淀細(xì)胞。去除培養(yǎng)基。

7. 用新的培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞。傳代。

39.在Sf9, Sf21, 和high Five細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時，肝素的使用量是多少？

為了防止懸浮培養(yǎng)細(xì)胞聚集的形成，使用肝素濃度為10單位/毫升細(xì)胞懸液。

40.在重新凍存sf9細(xì)胞前，它可以傳多少代？隨著傳代的次數(shù)的增加，它的感染能力會降低嗎？

通常情況當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過30次傳代后，應(yīng)該返回凍存。無論什么時候計數(shù)時，都應(yīng)該檢查細(xì)胞活力。如果超過95％的細(xì)胞保持有活力和在大約30小時左右加倍，細(xì)胞仍然可以使用。如果活力和加倍時間下降，它們的感染力將不在是有效的。

41.貯存在冰箱中的瓶口已開的培養(yǎng)基，在放置幾天后顏色變紫?

這主要是由于在暴露到周圍的CO2水平時，碳酸氫納導(dǎo)致了pH值的上升。您可以在使用前松開瓶口，在CO2培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)基10-15分鐘，來校正溶液的pH值（確定松開瓶口以保證氣體交換）。

42. 細(xì)胞培養(yǎng)基偶然被凍，可否繼續(xù)使用？

如果細(xì)胞培養(yǎng)基偶然被凍，您應(yīng)該熔化培養(yǎng)基并觀察是否有沉淀產(chǎn)生。如果沒有沉淀產(chǎn)生，培養(yǎng)基可以正常使用，如果出現(xiàn)沉淀，只能丟棄這些培養(yǎng)基。

43. 無血清培養(yǎng)與有血清培養(yǎng)使用的抗生素量一樣嗎？

當(dāng)在無血清培養(yǎng)基中添加抗生素時，降低**少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50%。血清蛋白會結(jié)合和滅活一些抗生素。在無血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被滅活，可能對于細(xì)胞達到毒性水平。

44. 培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素后，可長期保存嗎？

一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時，您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。

45.培養(yǎng)基及其它添加物和試劑可反復(fù)凍融嗎？

大部分添加物和試劑**多可以凍融3次，如果次數(shù)更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會影響它的性能。

46.為什么要在溶解的一周內(nèi)使用貯存在4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液?#p#分頁標(biāo)題#e#

胰蛋白酶在4℃就可能開始降解，如果在室溫下放置超過30分鐘，就會變得不穩(wěn)定。

47.保存血清**好的方法?

我們建議血清應(yīng)保存在-5℃**-2O℃。若存放于4℃時，請勿超過一個月。若一次無法用完一瓶，建議無菌分裝血清**恰當(dāng)?shù)臏缇萜鲀?nèi)，再放回冷凍。

48. 如何解凍血清才不會使產(chǎn)品質(zhì)量受損?#p#分頁標(biāo)題#e#

將血清從冷凍箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室溫下使之全融。但必須注意的是，融解過程中必須規(guī)則地?fù)u晃均勻。

49. 血清解凍后發(fā)現(xiàn)有絮狀沉淀物出現(xiàn)，該如何處理?

血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因，但**普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解凍后，也會存在于血清中，亦是造成沉淀物的原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質(zhì)量。

若欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝**無菌離心管內(nèi)，以400g稍微離心,上清液即可接著加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾。**好不使用過濾的方法去除這些絮狀沉淀物，因為它可能會阻塞過濾膜。

50. 為什么要熱滅活血清?

加熱可以滅活補體系統(tǒng)。激活的補體參與溶解細(xì)胞事件，刺激平滑肌收縮，細(xì)胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在免疫學(xué)研究，培養(yǎng)ES細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞時，推薦使用熱滅活血清。

51. 有必要做熱滅活嗎?

實驗顯示，經(jīng)過正確處理的熱滅活血清，對大多數(shù)的細(xì)胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過的血清對細(xì)胞的生長只有微小的促進，或完全沒有任何作用，甚**通常因為高溫處理影響了血清的質(zhì)量，而造成細(xì)胞生長速率的降低。而經(jīng)過熱處理的血清，沉淀物的形成會顯著的增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察，像是“小黑點”，常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在37℃環(huán)境中，又會使此沉淀物更增多，使研究者誤認(rèn)為是微生物的分裂擴增。

若非必須，可以不需要做熱處理這一步。不但節(jié)省時間，更確保血清的質(zhì)量!

52. 為什么儲存在冰箱中的胎牛血清會出現(xiàn)沉淀?

有些胎牛血清產(chǎn)品沒有預(yù)老化，儲存在2－8℃時，血清中的各種蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。這應(yīng)該不會影響血清的質(zhì)量。推薦在－20℃儲存胎牛血清，避免反復(fù)凍融。

53. 如何避免沉淀物的產(chǎn)生?

我們建議您在使用血清的時候，注意下列的操作:

(1)解凍血清時，請按照所建議的逐步解凍法(-20℃**4℃**室溫)，若血清解凍時改變的溫度太大(如-20℃**37℃)，非常容易產(chǎn)生沉淀物。

(2)解凍血清時，請隨時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。

(3)請勿將血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會因此受到損害，而影響血清的質(zhì)量。

(4)血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無須做此步驟。

(5)若必須做血清的熱滅活，請遵守56℃，30分鐘的原則，并且隨時搖晃均勻。溫度過高，時間過久或搖晃不均勻，都會造成沉淀物的增多。
 
 
 
 
 
一、 實驗室環(huán)境的原因
. p4 N) |2 |( s' X% M2 z: V, w. }" I3 W6 J
普通實驗室由于潔凈程度不高，粉塵相對較多，微生物極易充斥到空氣中，
. m6 C) i# ?0 A! a W. p6 W( k進而在培養(yǎng)箱與超凈工作臺之間傳遞細(xì)胞時，附著于細(xì)胞培養(yǎng)瓶皿上，再經(jīng)過其他途徑污染細(xì)胞。 9 p* [' h0 D$ h- P6 V0 G
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實驗室中無法做到完全無菌，只能通過清潔衛(wèi)生與消毒措施來盡量減少雜菌的滋生數(shù)量。打掃衛(wèi)生時要注意不留衛(wèi)生死角，清潔徹底。擦拭地板、臺面等，要用配制好的消毒液，常見的有新潔爾滅（又稱苯扎溴銨，使用濃度0.1%）等。實驗室消毒常用紫外燈，簡單方便。另外醋酸熏蒸也很有效果，但是對金屬設(shè)備有緩慢的腐蝕作用，應(yīng)低頻率應(yīng)用。臭氧、戊二醛等殺菌方式常用于潔凈車間的消毒，對人體機能有所損害，使用時應(yīng)注意安全。實驗室中要保持空氣干燥，廣東天氣多潮濕，應(yīng)定期除濕。**好有通風(fēng)系統(tǒng)，讓空氣流通不渾濁。室溫不宜過高，**好保持在30℃以下。
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: ]8 K& L. X& Q) m! L) N. r二、 試劑溶液的原因
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$ }( o* _ @# v! ~/ H; V4 N' x3 W6 d動物細(xì)胞培養(yǎng)的試劑溶液主要有培養(yǎng)基、PBS、胰酶消化液。由于PBS為高
$ [( 5 ]6 [* Z6 _壓滅菌，胰酶用量少，較容易控制污染，只需在操作時注意即可。而培養(yǎng)基用量大，本身營養(yǎng)豐富，適合很多微生物生長，采取的又是過濾式除菌，是無菌防控的重點。1 }6 J4 u' k* D. G+ g
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過濾通常有濾芯與濾膜兩種功率介質(zhì)。濾芯價格較貴，但能承受較大壓力，一次性可過濾大量體積液體，可以循環(huán)使用。濾膜價格低廉，為一次性耗材，承壓力較小，過濾速度慢于濾芯，一般是0.45um和0.22um孔徑的兩張濾膜配合使用，在過濾過程中容易破裂。技術(shù)中心（研究院）目前采用的是濾膜過濾方式，由蠕動泵提供壓力。在培養(yǎng)基制備過程中，應(yīng)注意：1培養(yǎng)基粉末應(yīng)完全溶解，否則易堵塞濾膜，致使壓力過大而使濾膜破裂；2蠕動泵轉(zhuǎn)速要適度，避免產(chǎn)生過大壓力；3過濾后親自拆開濾器，觀察濾膜是否完好。建議在過濾過程中取樣20~40ml裝入培養(yǎng)瓶，放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一周，鏡檢無異常后再使用，可保證安全性。# A: l Y# h$ R* B* j% v* c2 p#p#分頁標(biāo)題#e#
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三、 器皿的原因2 B0 p1 C. J( u+ E9 h* P( i% h#p#分頁標(biāo)題#e#
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主要包括藍蓋瓶、移液管、廢液缸、滴管、培養(yǎng)瓶等玻璃器皿，均為可高壓
2 K: O, m, ]- t* B3 a; E物品，在開瓶蓋或使用時注意用火焰灼燒一遍。無菌操作時注意瓶口不要殘留液體，如有殘留，及時用酒精棉球擦拭。技術(shù)中心有的實驗室采用的是一次性培養(yǎng)瓶，效果好，安全性高，但成本也較高。
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' Z3 k& D! k1 L5 H四、 設(shè)備的原因
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& w1 R! 5 a! e: t主要包括超凈工作臺、二氧化碳培養(yǎng)箱、水浴鍋、電動移液槍等。# O, f, j0 d! u5 f9 w

$ C& M$ N) q9 {* F; E1、超凈工作臺：是我們進行無菌操作的基礎(chǔ)和保障。按無菌風(fēng)的流向可分為從上向下的垂直風(fēng)類型和從里向外的水平風(fēng)類型。目前我部門使用的均為單面垂直風(fēng)類型超凈臺。超凈臺通過頂層的高效空氣過濾器提供無菌風(fēng)，保證內(nèi)部的無菌環(huán)境。使用超凈臺應(yīng)注意：1）高效濾器正常使用壽命通常為一年到一年半，應(yīng)定期更換。2）每月定期進行超凈臺的無菌檢測，大致方法為：紫外殺菌后，臺面上放置4到5個瓊脂平板，風(fēng)機開動30分鐘，然后培養(yǎng)1**2天，觀察平板染菌情況；3）避免上風(fēng)操作：操作中，手或物品盡量避免出現(xiàn)在開蓋溶液的上方，以防止無菌風(fēng)將雜菌或塵粒吹入溶液中；4）清潔衛(wèi)生：平時我們**注重的是清潔臺面，卻容易忽略其他衛(wèi)生死角。紫外燈管和日光燈管處于超凈臺上方，無菌風(fēng)會將附著其上的灰塵、雜菌吹下；大多數(shù)超凈臺中的酒精燈表面都是臟的，多為培養(yǎng)基和灰塵的混合物，是超凈臺內(nèi)的**大污染源，卻**易被人忽視。
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1 F o: R& ^1 `/ t T* a% u2、二氧化碳培養(yǎng)箱：為細(xì)胞生長提供良好的內(nèi)環(huán)境。需要注意：1）定期更換高效濾器；2）發(fā)生染菌后要對內(nèi)部進行徹底消毒，隔板**好用酒精灼燒或高壓滅菌；3）下部的盛水器中**好加入雙抗。% P% s! G1 b- W. y" c) g# G. r+ Y
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3、水浴鍋：處在開放式環(huán)境下，溫度一般設(shè)定在37℃，極易有雜菌在水中滋生，附著在溶液瓶表面帶入超凈臺內(nèi)。要經(jīng)常更換蒸餾水，定期將水溫調(diào)**高溫進行殺菌。* o8 F& L6 u* k3 n9 K5 M) P+ D
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4、電動移液槍：內(nèi)部結(jié)構(gòu)是外膠管、0.22um空氣過濾器、微型電動機。外膠管是移液器和移液管銜接的部位，應(yīng)時常用75%酒精擦拭。移液操作時要特別注意防止液體倒吸，一旦發(fā)生應(yīng)立即用酒精擦拭外膠管，更換空氣濾器，才能再次使用移液器。進液的空氣濾器用清水清洗過后，放入干燥箱內(nèi)烘干，經(jīng)檢驗合格后重復(fù)使用。
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